sydlabs：蛋白酶K溶液（肽酶 K、內(nèi)切蛋白酶 K、內(nèi)肽酶 K、蛋白酶 K、內(nèi)肽酶 K、Tritirachium 堿性蛋白酶、Tritirachium 蛋白絲氨酸蛋白酶）

蛋白酶 K 溶液通常用于蛋白質(zhì)消化、DNA 提取、RNA 純化、直接 PCR 和基因分型。由于它能非常有效地滅活 DNase 和 RNase，因此在核酸制備過程中添加重組蛋白酶 K，以分離高度天然、未受損的 DNA 或 RNA；它用于直接 PCR 試劑盒，通過破壞細(xì)胞裂解物（組織或細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞）中的蛋白質(zhì)來進(jìn)行基因分型，并釋放基因組 DNA。

蛋白酶 K 是一種廣譜絲氨酸蛋白酶，很初從真菌 Engyodontium album 中分離出來。該蛋白酶因其消化角蛋白的能力而被命名為“蛋白酶 K"。晶體和分子結(jié)構(gòu)研究表明，該酶屬于枯草桿菌蛋白酶家族，其活性位點(diǎn)具有催化三聯(lián)體 (Asp39-His69-Ser224)。蛋白酶 K 酶沒有明顯的切割特異性，優(yōu)先切割位點(diǎn)是鄰近疏水性氨基酸的肽鍵。

在還原劑（例如 5 mM DTT）存在下，蛋白酶 K 表現(xiàn)出更高的蛋白水解活性。蛋白酶 K 被絲氨酸蛋白酶抑制劑（例如 PMSF、DFP 和 AEBSF）抑制。

蛋白酶 K 在 1% Triton X-100 中具有活性，在 0.5% (w/v) SDS 中全具有活性，可使蛋白質(zhì)底物變性以提高消化率。該酶在 50-200 ug/mL、pH 7.5-8.0、37 °C 時效果佳，并且通常會因后續(xù)苯酚提取而變性。孵育時間從 30 分鐘到 18 小時不等，蛋白酶 K 可以在長時間孵育期間自動消化。

重組蛋白酶 K 是天然蛋白酶的突變體，具有更高的比活性和產(chǎn)量以及更寬的 pH 和溫度范圍。大規(guī)模重組酶生產(chǎn)具有批次一致性、純度高和成本效益高等優(yōu)勢。重組蛋白酶 K 的無 DNA 性質(zhì)使其非常適合分離 PCR 和 RT-PCR 模板。

MB112：蛋白酶 K 溶液，PCR 的（20 毫克/毫升）

重組蛋白酶K來自酵母細(xì)胞，克隆了編碼Engyodontium album（Tritirachium album）內(nèi)溶蛋白酶的基因。
CAS 號：39450-01-6。
EC：3.4.21.64。
分子量：29.3 kDa。
等電點(diǎn)：8.9。
pH范圍：4.5-12.0；在pH 7.5-11.5范圍內(nèi)具有高活性。
單位定義： 1 個單位的蛋白酶 K 定義為在 37°C、pH 7.5 下每分鐘從酪蛋白產(chǎn)生 1 umol 酪氨酸的酶活性。
比活性：≥ 780 單位/ml 蛋白質(zhì)。
溫度曲線：建議溫度范圍 37-70°C； 70°C 時具有很大活性。
消光系數(shù)：E ^1%= 14.2； 280 nm，10 mM NaCl 和 5 mM CaCl2，pH 8.0。
純度：對每批 PCR 的重組蛋白酶 K 溶液進(jìn)行測試，確保不含 RNase、DNase 和 DNA。在 40 µg 蛋白酶 K 與 2 ug RNA 在 37°C 下孵育 2 小時的質(zhì)量控制程序中未檢測到 RNase。在 40 µg 蛋白酶 K 與 1 ug λ DNA 在 37°C 下孵育 6 小時的質(zhì)量控制程序中未檢測到 DNase。該制劑被認(rèn)為不含 RNase 和 DNase。
配方：0.2 μM 過濾溶液。
濃度：20毫克/毫升。
溶液配制：PCR 的蛋白酶 K 溶液 (20 mg/ml) 使用 0.22 µm 過濾器進(jìn)行滅菌，并提供在 50% 滅菌甘油中，以等分試樣在 24°C 至 -80°C 的寬溫度范圍內(nèi)儲存。推薦的蛋白酶 K 稀釋緩沖液：20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、1 mM CaCl2；或 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、1 mM CaCl2 和 2% 甘油。
活化劑：1-5 mM Ca ²⁺。為了刺激蛋白酶 K 活性，可以添加1-5 mM Ca ²⁺ 。使用激活劑進(jìn)行優(yōu)化可以顯著提高蛋白酶活性。添加EDTA除去鈣后，酶活性會降低25%。如果 EDTA-Ca ²⁺酶活性會降低 80%通過凝膠過濾從酶溶液中除去復(fù)合物，同時可以通過添加過量的Ca ²⁺來部分恢復(fù)復(fù)合物。
抑制劑：DIFP 或 PMSF。蛋白酶 K 被 DIFP 或 PMSF 滅活（PMSF 很終濃度為 5 mM）。然而，它不受 EDTA、碘乙酸、胰蛋白酶特異性抑制劑 TLCK、胰凝乳蛋白酶特異性抑制劑 TPCK 和對氯汞苯甲酸鹽的抑制。

運(yùn)輸：PCR 的重組蛋白酶 K 溶液 (20 mg/ml) 用冰袋運(yùn)輸。收到后，立即將其存放在下面建議的溫度下。
穩(wěn)定性和儲存：
使用手動除霜冰箱并避免重復(fù)凍融循環(huán)。
自收到之日起超過 2 年，在 –20°C 下保存。
自收到之日起>1 年，在 2–8°C 下保存。

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